References

fcmedicine

Фундаментальная и клиническая медицина

Fundamental and Clinical Medicine

2500-07642542-0941

КемГМУ

10.23946/2500-0764-2020-5-3-50-58

fcmedicine-298

Research Article

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

ORIGINAL RESEARCH

Анализ внутреннего пути апоптоза в эндотелиальных клетках под воздействием кальций-фосфатных бионов

Analysis of intrinsic apoptosis in endothelial cells exposed to calcium phosphate bions

https://orcid.org/0000-0002-6652-5745

Маркова

В. Е.

Markova

V. E.

Маркова Виктория Евгеньевна, лаборант-исследователь лаборатории фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины

650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, д. 6

Ms. Victoria E. Markova, Research Technician, Laboratory for Vascular Biology, Division of Experimental Medicine

6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002

markve@kemcardio.ru

https://orcid.org/0000-0002-1518-3888

Шишкова

Д. К.

Shishkova

D. K.

Шишкова Дарья Кирилловна, младший научный сотрудник лаборатории фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины

650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, д. 6

Ms. Daria K. Shishkova, MSc, Junior Researcher, Laboratory for Vascular Biology, Division of Experimental Medicine

6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002

https://orcid.org/0000-0001-8679-4857

Кутихин

А. Г.

Kutikhin

A. G.

Кутихин Антон Геннадьевич, кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины

650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, д. 6

Dr. Anton G. Kutikhin, MD, PhD, Head of the Laboratory for Vascular Biology, Division of Experimental Medicine

6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний»РоссияResearch Institute for Complex Issues of Cardiovascular DiseasesRussian Federation

2020

29092020

535058

2020

Маркова В.Е., Шишкова Д.К., Кутихин А.Г.

Markova V.E., Shishkova D.K., Kutikhin A.G.

Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.

This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.

https://fcm.kemsmu.ru/jour/article/view/298

Цель. Изучить внутренний путь апоптоза в первичных артериальных эндотелиальных клетках в результате их экспозиции кальций-фосфатным бионам (КФБ). Материалы и методы. Первичные эндотелиальные клетки коронарной артерии человека были экспонированы сферическим и игольчатым КФБ в течение 4 часов с последующим выделением общего белка и фракционированием органелл с разделением митохондриального и цитозольного белка. При помощи иммуноблоттинга определяли уровень митохондриального маркера потенциал-зависимого анионоселективного канала 1, цитозольного маркера глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и белков внутреннего пути апоптоза цитохрома с, HtrA2/Omi в митохондриях и цитозоле, а также уровень общей и активной каспазы-9 и каспазы-3 в общем белке, собранном с вышеуказанных культур эндотелиальных клеток в трех независимых экспериментах. Результаты. Воздействие КФБ не всегда сопровождалось транслокацией данных белков из митохондрий в цитозоль. В зависимости от формы КФБ образцы выделенного из первичных артериальных эндотелиальных клеток белка различались как по спектру, так и по содержанию специфических белков. Лишь один эксперимент из трех показал стойкое повышение уровня активной каспазы-9 и каспазы-3 в экспонированных КФБ клетках в сравнении с контрольной группой (ФСБ), в то время как в остальных каспазы либо детектировались нестабильно, либо уровень активных каспаз не различался между контрольной и опытными группами. Уровни общей и активной каспазы-9 и каспазы-3 характеризовались конкордантностью, что свидетельствует о прямой корреляции между данными апоптотическими ферментами. Заключение. Представленные результаты показали неоднозначность механизмов эндотелиотоксического действия КФБ и необходимость дальнейшей расшифровки путей клеточной гибели под воздействием сферических КФБ и игольчатых КФБ, а также необходимость совершенствования методики оценки молекулярных путей клеточной гибели под воздействием КФБ.

Aim. To study intrinsic apoptosis in primary arterial endothelial cells treated with calcium phosphate bions (CPB). Materials and Methods. Primary human coronary artery endothelial cells were exposed to spherical or needle-shaped CPB during 4 hours with the subsequent extraction of total protein and subcellular fractionation to separate mitochondrial and cytosolic protein. We then performed Western blotting to measure the relative levels of a mitochondrial marker porin, cytosolic marker glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase and intrinsic apoptosis proteins cytochrome c and HtrA2/Omi in mitochondria and cytosol in addition to the levels of total and cleaved caspases-9 and caspases-3 in the total protein collected from three independent experiments. Results. Translocation of cytochrome c and HtrA2/Omi was not a mandatory consequence of CPB exposure. Relative levels of the measured proteins differed according to the particle shape. Out of three experiments, only one showed a significant increase in cleaved caspase-9 and caspase-3 in CPB-treated as compared with the mock-treated cells. In other experiments, cleaved caspases did not show a consistent elevation. The levels of total and cleaved caspase-9 and caspases-3 were concordant testifying to the direct correlation between them. Conclusion. As mechanisms of CPB-induced endothelial toxicity are poorly defined, they require further investigation employing optimized methods.

кальций-фосфатные бионыфосфат кальциягидроксиапатитэндотелиальные клеткиапоптозкаспазы

calcium phosphate bionscalcium phosphatehydroxyapatiteendothelial cellsapoptosiscaspases

Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0546- 2019-0002 «Патогенетическое обоснование разработки имплантатов для сердечно-сосудистой хирургии на основе биосовместимых материалов, с реализацией пациент-ориентированного подхода с использованием математического моделирования, тканевой инженерии и геномных предикторов».

This study was supported by the Complex Program of Basic Research under the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences within the Basic Research Topic of Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases № 0546- 2019-0002 “Pathogenetic basis for the development of cardiovascular implants from biocompatible materials using patient-oriented approach, mathematical modeling, tissue engineering, and genomic predictors”.

References1

Kutikhin AG, Velikanova EA, Mukhamadiyarov RA, Glushkova TV, Borisov VV, Matveeva VG, Antonova LV, Filip'ev DE, Golovkin AS, Shishkova DK, Burago AY, Frolov AV, Dolgov VY, Efimova OS, Popova AN, Malysheva VY, Vladimirov AA, Sozinov SA, Ismagilov ZR, Russakov DM, Lomzov AA, Pyshnyi DV, Gutakovsky AK, Zhivodkov YA, Demidov EA, Peltek SE, Dolganyuk VF, Babich OO, Grigoriev EV, Brusina EB, Barbarash OL, Yuzhalin AE. Apoptosis-mediated endothelial toxicity but not direct calcification or functional changes in anti-calcification proteins defines pathogenic effects of calcium phosphate bions. Sci Rep. 2016;6:27255. https://doi.org/10.1038/srep27255

Smith ER, Hewitson TD, Jahnen-Dechent W. Calciprotein particles: mineral behaving badly? Curr Opin Nephrol Hypertens. 2020;29(4):378-386. https://doi.org/10.1097/MNH.0000000000000609

Herrmann M, Schäfer C, Heiss A, Gräber S, Kinkeldey A, Büscher A, Schmitt MM, Bornemann J, Nimmerjahn F, Herrmann M, Helming L, Gordon S, Jahnen-Dechent W. Clearance of fetuin-A--containing calciprotein particles is mediated by scavenger receptor-A. Circ Res. 2012;111(5):575-584. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.111.261479

Köppert S, Büscher A, Babler A, Ghallab A, Buhl EM, Latz E, Hengstler JG, Smith ER, Jahnen-Dechent W. Cellular Clearance and Biological Activity of Calciprotein Particles Depend on Their Maturation State and Crystallinity. Front Immunol. 2018;9:1991. https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.01991

Peng HH, Wu CY, Young D, Martel J, Young A, Ojcius DM, Lee YH, Young JD. Physicochemical and biological properties of biomimetic mineralo-protein nanoparticles formed spontaneously in biological fluids. Small. 2013;9(13):2297-2307. https://doi.org/10.1002/smll.201202270

Шишкова Д.К., Синицкий М.Ю., Великанова Е.А., Кутихин А.Г. Кальций-фосфатные бионы индуцируют секрецию провоспалительных цитокинов интерлейкина-6 и интерлейкина-8 артериальными эндотелиальными клетками in vitro. Цитокины и воспаление. 2018;17(1-4):80 [Shishkova DK, Sinitsky MYu, Velikanova EA, Kutikhin AG. Calcium phosphate bions induce secretion of pro-inflammatory cytokines interleukin-6 and interleukin-8 by arterial endothelial cells in vitro. Cytokines and Inflammation. 2018;17(1-4):80. (In Russ.).]

Cahill PA, Redmond EM. Vascular endothelium- Gatekeeper of vessel health. Atherosclerosis. 2016;248:97-109. https://doi.org/10.1016/j.atherosclerosis.2016.03.007

Young JD, Martel J, Young D, Young A, Hung CM, Young L, Chao YJ, Young J, Wu CY. Characterization of granulations of calcium and apatite in serum as pleomorphic mineraloprotein complexes and as precursors of putative nanobacteria. PLoS One. 2009;4(5):e5421. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005421

Кутихин А.Г., Великанова Е.А., Шишкова Д.К., Матвеева В.Г., Григорьев Е.В., Барбараш О.Л. Форма кальций-фосфатных бионов определяет их токсичность для культур эндотелиальных клеток человека. Кардиологический вестник. 2019;XIV(4):34-41 [Kutikhin AG, Velikanova EA, Shishkova DK, Matveeva VG, Grigoriev EV, Barbarash OL. Shape of calcium phosphate bions dictates their toxicity for human venous and arterial endothelial cells. Cardiology Bulletin. 2019;XIV(4):34-41. (In Russ.).] https://doi.org/10.36396/MS.2019.15.4.004

Lebre F, Sridharan R, Sawkins MJ, Kelly DJ, Obrien F, Lavelle EC. The shape and size of hydroxyapatite particles dictate inflammatory responses following implantation. Sci Rep. 2017;7(1):2922. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03086-0

Sukhanova A, Bozrova SV, Sokolov PY, Berestovoy MA, Karaulov A, Nabiev I. Dependence of Nanoparticle Toxicity on Their Physical and Chemical Properties. Nanoscale Res Lett. 2018;13(1):44. https://doi.org/10.1186/s11671-018-2457-x

Galluzzi L, Vitale I, Aaronson SA, Abrams JM, Adam D, Agostinis P, Alnemri ES, Altucci L, Amelio I, Andrews DW, Annicchiarico-Petruzzelli M, Antonov AV, Arama E, Baehrecke EH, Barlev NA, Bazan NG, Bernassola F, Bertrand MJM, Bianchi K, Blagosklonny MV, Blomgren K, Borner C, Boya P, Brenner C, Campanella M, Candi E, Carmona-Gutierrez D, Cecconi F, Chan FK, Chandel NS, Cheng EH, Chipuk JE, Cidlowski JA, Ciechanover A, Cohen GM, Conrad M, Cubillos-Ruiz JR, Czabotar PE, D'Angiolella V, Dawson TM, Dawson VL, De Laurenzi V, De Maria R, Debatin KM, DeBerardinis RJ, Deshmukh M, Di Daniele N, Di Virgilio F, Dixit VM, Dixon SJ, Duckett CS, Dynlacht BD, El-Deiry WS, Elrod JW, Fimia GM, Fulda S, García-Sáez AJ, Garg AD, Garrido C, Gavathiotis E, Golstein P, Gottlieb E, Green DR, Greene LA, Gronemeyer H, Gross A, Hajnoczky G, Hardwick JM, Harris IS, Hengartner MO, Hetz C, Ichijo H, Jäättelä M, Joseph B, Jost PJ, Juin PP, Kaiser WJ, Karin M, Kaufmann T, Kepp O, Kimchi A, Kitsis RN, Klionsky DJ, Knight RA, Kumar S, Lee SW, Lemasters JJ, Levine B, Linkermann A, Lipton SA, Lockshin RA, López-Otín C, Lowe SW, Luedde T, Lugli E, MacFarlane M, Madeo F, Malewicz M, Malorni W, Manic G, Marine JC, Martin SJ, Martinou JC, Medema JP, Mehlen P, Meier P, Melino S, Miao EA, Molkentin JD, Moll UM, Muñoz-Pinedo C, Nagata S, Nuñez G, Oberst A, Oren M, Overholtzer M, Pagano M, Panaretakis T, Pasparakis M, Penninger JM, Pereira DM, Pervaiz S, Peter ME, Piacentini M, Pinton P, Prehn JHM, Puthalakath H, Rabinovich GA, Rehm M, Rizzuto R, Rodrigues CMP, Rubinsztein DC, Rudel T, Ryan KM, Sayan E, Scorrano L, Shao F, Shi Y, Silke J, Simon HU, Sistigu A, Stockwell BR, Strasser A, Szabadkai G, Tait SWG, Tang D, Tavernarakis N, Thorburn A, Tsujimoto Y, Turk B, Vanden Berghe T, Vandenabeele P, Vander Heiden MG, Villunger A, Virgin HW, Vousden KH, Vucic D, Wagner EF, Walczak H, Wallach D, Wang Y, Wells JA, Wood W, Yuan J, Zakeri Z, Zhivotovsky B, Zitvogel L, Melino G, Kroemer G. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death Differ. 2018;25:486-541. https://doi.org/10.1038/s41418-017-0012-4

Droga-Mazovec G, Bojic L, Petelin A, Ivanova S, Romih R, Repnik U, Salvesen GS, Stoka V, Turk V, Turk B. Cysteine cathepsins trigger caspase-dependent cell death through cleavage of bid and antiapoptotic Bcl-2 homologues. J Biol Chem. 2008;283(27):19140-19150. https://doi.org/10.1074/jbc.M802513200

Bidère N, Lorenzo HK, Carmona S, Laforge M, Harper F, Dumont C, Senik A. Cathepsin D triggers Bax activation, resulting in selective apoptosis-inducing factor (AIF) relocation in T lymphocytes entering the early commitment phase to apoptosis. J Biol Chem. 2003;278(33):31401-31411. https://doi.org/10.1074/jbc.M301911200

Шишкова Д.К., Великанова Е.А., Мухамадияров Р.А., Южалин А.Е., Кудрявцева Ю.А., Попова А.Н., Руссаков Д.М., Кутихин А.Г. Изучение механизма специфичной эндотелиотоксичности кальций-фосфатных бионов. Сибирский научный медицинский журнал. 2019;39(4):12-21 [Shishkova DK, Velikanova EA, Mukhamadiyarov RA, Yuzhalin AE, Kudryavtseva YuA, Popova AN, Russakov DM, Kutikhin AG. Lysosome-dependent cell death defines specific endothelial toxicity of calcium phosphate bions. Sibirskiy nauchnyy meditsinskiy zhurnal. 2019;39(4):12-21. (In Russ.).] https://doi.org/10.15372/SSMJ20190402

Kim HE, Du F, Fang M, Wang X. Formation of apoptosome is initiated by cytochrome c-induced dATP hydrolysis and subsequent nucleotide exchange on Apaf-1. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(49):17545-17550. https://doi.org/10.1073/pnas.0507900102

Reubold TF, Eschenburg S. A molecular view on signal transduction by the apoptosome. Cell Signal. 2012;24(7):1420- 1425. https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2012.03.007

Yuan S, Akey CW. Apoptosome structure, assembly, and procaspase activation. Structure. 2013;21(4):501-515. https://doi.org/10.1016/j.str.2013.02.024

Zou H, Li Y, Liu X, Wang X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 1999;274(17):11549-11556. https://doi.org/10.1074/jbc.274.17.11549

Li Y, Zhou M, Hu Q, Bai XC, Huang W, Scheres SH, Shi Y. Mechanistic insights into caspase-9 activation by the structure of the apoptosome holoenzyme. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(7):1542-1547. https://doi.org/10.1073/pnas.1620626114

Shi Y. Caspase activation, inhibition, and reactivation: a mechanistic view. Protein Sci. 2004;13(8):1979-1987. https://doi.org/10.1110/ps.04789804

Lavrik IN, Golks A, Krammer PH. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J Clin Invest. 2005;115(10):2665- 2672. https://doi.org/10.1172/JCI26252

Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, Srinivasula SM, Ahmad M, Alnemri ES, Wang X. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 1997;91(4):479-489. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(00)80434-1

Fujita E, Egashira J, Urase K, Kuida K, Momoi T. Caspase-9 processing by caspase-3 via a feedback amplification loop in vivo. Cell Death Differ. 2001;8(4):335-344. https://doi.org/10.1038/sj.cdd.4400824

Bratton SB, Walker G, Srinivasula SM, Sun XM, Butterworth M, Alnemri ES, Cohen GM. Recruitment, activation and retention of caspases-9 and -3 by Apaf-1 apoptosome and associated XIAP complexes. EMBO J. 2001;20(5):998-1009. https://doi.org/10.1093/emboj/20.5.998

Shiozaki EN, Chai J, Rigotti DJ, Riedl SJ, Li P, Srinivasula SM, Alnemri ES, Fairman R, Shi Y. Mechanism of XIAP-mediated inhibition of caspase-9. Mol Cell. 2003;11(2):519-527. https://doi.org/10.1016/s1097-2765(03)00054-6

Wu G, Chai J, Suber TL, Wu JW, Du C, Wang X, Shi Y. Structural basis of IAP recognition by Smac/DIABLO. Nature. 2000;408(6815):1008-1012. https://doi.org/10.1038/35050012

Gao Z, Tian Y, Wang J, Yin Q, Wu H, Li YM, Jiang X. A dimeric Smac/diablo peptide directly relieves caspase-3 inhibition by XIAP. Dynamic and cooperative regulation of XIAP by Smac/ Diablo. J Biol Chem. 2007;282(42):30718-30727. https://doi.org/10.1074/jbc.M705258200

Martins LM, Iaccarino I, Tenev T, Gschmeissner S, Totty NF, Lemoine NR, Savopoulos J, Gray CW, Creasy CL, Dingwall C, Downward J. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 2002;277(1):439-444. https://doi.org/10.1074/jbc.M109784200

Vande Walle L, Lamkanfi M, Vandenabeele P. The mitochondrial serine protease HtrA2/Omi: an overview. Cell Death Differ. 2008;15(3):453-460. https://doi.org/10.1038/sj.cdd.4402291

Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, Okawa K, Iwamatsu A, Nagata S. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 1998;391(6662):43- 50. https://doi.org/10.1038/34112

Sakahira H, Enari M, Nagata S. Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis. Nature. 1998;391(6662):96-99. https://doi.org/10.1038/34214

Larsen BD, Sørensen CS. The caspase-activated DNase: apoptosis and beyond. FEBS J. 2017;284(8):1160-1170. https://doi.org/10.1111/febs.13970

Шишкова Д.К., Глушкова Т.В., Ефимова О.С., Попова А.Н., Малышева В.Ю., Колмыков Р.П., Исмагилов З.Р., Гутаковский А.К., Живодков Ю.А., Кожухов А.С., Севостьянов О.Г., Долганюк В.Ф., Кудрявцева Ю.А., Кутихин А.Г. Морфологическая и химическая характеризация магний-фосфатных и кальций-фосфатных бионов. Фундаментальная и клиническая медицина. 2019;4(2):6- 16 [Shishkova DK, Glushkova TV, Efimova OS, Popova AN, Malysheva VYu, Kolmykov RP, Ismagilov ZR, Gutakovsky AK, Zhivodkov YuA, Kozhukhov AS, Sevostyanov OG, Dolganyuk VF, Kudryavtseva YuA, Kutikhin AG. Morphological and chemical characterization of magnesium phosphate and calcium phosphate bions. Fundamental and Clinical Medicine. 2019;4(2):6-16. (In Russ.).] https://doi.org/10.23946/2500-0764-2019-4-2-6-16

Шишкова Д.К., Глушкова Т.В., Ефимова О.С., Попова А.Н., Малышева В.Ю., Колмыков Р.П., Исмагилов З.Р., Гутаковский А.К., Живодков Ю.А., Кожухов А.С., Долганюк В.Ф., Барбараш О.Л., Кутихин А.Г. Сравнение морфологических и химических свойств сферических и игольчатых кальций-фосфатных бионов. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2019;8(1):59-69 [Shishkova DK, Glushkova TV, Efimova OS, Popova AN, Malysheva VYu, Kolmykov RP, Ismagilov ZR, Gutakovsky AK, Zhivodkov YuA, Kozhukhov AS, Dolganyuk VF, Barbarash OL, Kutikhin AG. Morphological and chemical properties of spherical and needle calcium phosphate bions. Kompleksnye problemy serdechno-sosudistykh zabolevaniy. 2019;8(1):59-69 2019.(In Russ.).] https://doi.org/10.17802/2306-1278-2019-8-1-59-69

The authors declare that there are no conflicts of interest present.