Колониеформирующие эндотелиальные клетки - кандидатная культура для тканевой сосудистой инженерии: паспорт генного и протеомного профиля

Цель. Валидация культуры колониеформирующих эндотелиальных клеток (КФЭК) в качестве кандидатной культуры для тканевой сосудистой инженерии на основе сравнительного анализа протеомного профиля и профиля генной экспрессии с сравнении культурами эндотелиальных клеток пупочной вены человека (human umbilical vein endothelial cells HUVEC) и эндотелиальных клеток коронарной артерии человека (human coronary artery endothelial cells, HCAEC).

Материалы и методы. Культура КФЭК получена культивированием мононуклеаров периферической крови от пациентов с ишемической болезнью сердца. В качестве контроля взята коммерческая культура HCAEC, произведённая фирмой Cell Applications и культура HUVEC, полученная по адаптированному протоколу Jaffe.

Для выделения тотальной РНК клетки лизировали тризолом и обрабатывали ДНКазой. ДНК-библиотеки количественно определяли с помощью количественной полимеразной цепной реакции. Библиотеки ДНК эквимолярно смешивали и секвенировали на HiSeq 2000 (Illumina) с длиной парно-концевых прочтений 2x125 нуклеотидов.

Традиционный иммуноблотинг с применением панэндотелиальных маркеров CD31, vWF, VEGFR2/KDR, маркера эндотелиальных клеток-предшественников CD34, маркеров эндотелиально-мезенхимального перехода Snail+Slug, маркеров спецификации эндотелиальной дифференцировки: артериальной HEY2, венозной COUP-TFII и лимфатической LYVE1, VEGFR2. Дот-блоттинг 55 секретируемых белков, связанных с ангиогенезом, выполняли с использованием набора (Human Angiogenesis Array Kit, R&D Systems), в соответствии с протоколом производителя.

Результаты. КФЭК сверхэкспрессирует маркеры всех трех линий эндотелиальной дифференцировки (KDR, VWF, CD34, NRP2, FLT4 и LYVE1 по сравнению с HCAEC; NOTCH4, DLL2) и LYVE1 по сравнению с HUVEC). Про-теомное профилирование подтверждает промежуточную эндотелиальную спецификацию КФЭК по сравнению с HCAEC и HUVEC в отношении экспрессии HEY2, LYVE1, VEGFR3, Snail и Slug. Выявлено 261 дифференциально экспрессируемых генов (ДЭГ) между КФЭК и HUVEC, и 470 ДЭГ между КФЭК и HCAEC.

Заключение. Базовый профиль генной экспрессии колониеформирующих эндотелиальных клеток соответствует зрелым эндотелиальным клеткам и свидетельствует о промежуточной эндотелиальной спецификации КФЭК, может быть рекомендована для тканевой сосудистой инженерии.

1. Cines D.B., Pollak E.S., Buck C.A., Loscalzo J., Zimmerman G.A., McEver R.P., Pober J.S., Wick T.M., Konkle B.A., Schwartz B.S., Barnathan E.S., McCrae K.R., Hug B.A., Schmidt A.M., Stern D.M. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 1998;91(10):3527-3561.

2. Niklason L.E., Lawson J.H. Bioengineered human blood vessels. Science. 2020;370(6513):eaaw8682. https://doi.org/10.1126/science.aaw8682

3. Ardila D.C., Liou J.J., Maestas D., Slepian M.J., Badowski M., Wagner W.R., Harris D., Vande Geest J.P. Surface Modification of Electrospun Scaffolds for Endothelialization of Tissue-Engineered Vascular Grafts Using Human Cord Blood-Derived Endothelial Cells. J. Clin. Med. 2019;8(2):185. https://doi.org/10.3390/jcm8020185

4. Yoder M.C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2012;2(7):a006692. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a006692

5. Keighron C., Lyons C.J., Creane M., O'Brien T., Liew A. Recent Advances in Endothelial Progenitor Cells Toward Their Use in Clinical Translation. Front. Med. (Lausanne). 2018;5:354. https://doi.org/10.3389/fmed.2018.00354

6. Medina R.J., O'Neill C.L., Sweeney M., Guduric-Fuchs J., Gardiner T.A., Simpson D.A., Stitt A.W. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Med. Genomics. 2010;3:18. https://doi.org/10.1186/1755-8794-3-18

7. Banno K., Yoder M.C. Tissue regeneration using endothelial colony-forming cells: promising cells for vascular repair. Pediatr. Res. 2018;83(1-2):283-290. https://doi.org/10.1038/pr.2017.231

8. Tan W., Boodagh P., Selvakumar P.P., Keyser S. Strategies to counteract adverse remodeling of vascular graft: A 3D view of current graft innovations. Front. Bioeng. Biotechnol. 2023;10:1097334. https://doi.org/10.3389/fbioe.2022.1097334

9. Yoon C.H., Hur J., Park K.W., Kim J.H., Lee C.S., Oh I.Y., Kim T.Y., Cho H.J., Kang H.J., Chae I.H., Yang H.K., Oh B.H., Park Y.B., Kim H.S. Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases. Circulation. 2005;112(11):1618-1627. https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.104.503433

10. Medina R.J., Barber C.L., Sabatier F., Dignat-George F., Melero-Martin J.M., Khosrotehrani K., Ohneda O., Randi A.M., Chan J.K.Y., Yamaguchi T., Van Hinsbergh V.W.M., Yoder M.C., Stitt A.W. Endothelial Progenitors: A Consensus Statement on Nomenclature. Stem Cells Transl. Med. 2017;6(5):1316-1320. https://doi.org/10.1002/sctm.16-0360

11. Medina R.J., O'Neill C.L., O'Doherty T.M., Knott H., Guduric-Fuchs J., Gardiner T.A., Stitt A.W. Myeloid angiogenic cells act as alternative M2 macrophages and modulate angiogenesis through interleukin-8. Mol. Med. 2011;17(9-10):1045-1055. https://doi.org/10.2119/molmed.2011.00129

12. Gifre-Renom L., Daems M., Luttun A., Jones E.A.V. Organ-Specific Endothelial Cell Differentiation and Impact of Microenvironmental Cues on Endothelial Heterogeneity. Int. J. Mol. Sci. 2022;23(3):1477. https://doi.org/10.3390/ijms23031477

13. Paik D.T., Tian L., Williams I.M., Rhee S., Zhang H., Liu C., Mishra R., Wu S.M., Red-Horse K., Wu J.C. Single-Cell RNA Sequencing Unveils Unique Transcriptomic Signatures of Organ-Specific Endothelial Cells. Circulation. 2020;142(19):1848-1862. https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.119.041433

14. Aird W.C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circ. Res. 2007;100(2):158-173. https://doi.org/10.1161/01.RES.0000255691.76142.4a

15. Koenig A.L., Shchukina I., Amrute J., Andhey P.S., Zaitsev K., Lai L., Bajpai G., Bredemeyer A., Smith G., Jones C., Terrebonne E., Rentschler S.L., Artyomov M.N., Lavine K.J. Single-cell transcriptomics reveals cell-type-specific diversification in human heart failure. Nat. Cardiovasc. Res. 2022;1(3):263-280. https://doi.org/10.1038/s44161-022-00028-6

16. Abdelgawad M.E., Desterke C., Uzan G., Naserian S. Single-cell transcriptomic profiling and characterization of endothelial progenitor cells: new approach for finding novel markers. Stem Cell Res. Ther. 2021;12(1):145. https://doi.org/10.1186/s13287-021-02185-0

17. Steinle J.J., Meininger C.J., Forough R., Wu G., Wu M.H., Granger H.J. Eph B4 receptor signaling mediates endothelial cell migration and proliferation via the phosphatidylinositol 3-kinase pathway. J. Biol. Chem. 2002;277(46):43830-43835. https://doi.org/10.1074/jbc.M207221200

18. Zhang H.F., Wang Y.L., Tan Y.Z., Wang H.J., Tao P., Zhou P. Enhancement of cardiac lymphangiogenesis by transplantation of CD34+VEGFR-3+ endothelial progenitor cells and sustained release of VEGF-C. Basic Res. Cardiol. 2019;114(6):43. https://doi.org/10.1007/s00395-019-0752-z

19. Smadja D.M., Bieche I., Silvestre J.S., Germain S., Cornet A., Laurendeau I., Duong-Van-Huyen J.P., Emmerich J., Vidaud M., Aiach M., Gaussem P. Bone morphogenetic proteins 2 and 4 are selectively expressed by late outgrowth endothelial progenitor cells and promote neoangiogenesis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2008;28

20. Obi S., Yamamoto K., Shimizu N., Kumagaya S., Masumura T., Sokabe T., Asahara T., Ando J. Fluid shear stress induces arterial differentiation of endothelial progenitor cells. J. Appl. Physiol. (1985). 2009;106(1):203-211. https://doi.org/10.1152/japplphysiol.00197.2008

21. Muto A., Model L., Ziegler K., Eghbalieh S.D., Dardik A. Mechanisms of vein graft adaptation to the arterial circulation: insights into the neointimal algorithm and management strategies. Circ. J. 2010;74(8):1501-1512. https://doi.org/10.1253/circj.cj-10-0495

22. Owens C.D., Gasper W.J., Rahman A.S., Conte M.S. Vein graft failure. J. Vasc. Surg. 2015;61(1):203-216. https://doi.org/10.1016/j.jvs.2013.08.019

23. Cai Q., Liao W., Xue F., Wang X., Zhou W., Li Y., Zeng W. Selection of different endothelialization modes and different seed cells for tissue-engineered vascular graft. Bioact. Mater. 2021;6(8):2557-2568. https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2020.12.021

24. Matveeva V., Khanova M., Sardin E., Antonova L., Barbarash O. Endovascular Interventions Permit Isolation of Endothelial Colony-Forming Cells from Peripheral Blood. Int J Mol Sci. 2018; 19 (11): 3453. https://doi.org/10.3390/ijms19113453.

25. Великанова Е.А., Матвеева В.Г., Ханова М.Ю., Антонова Л.В. Влияние напряжения сдвига на свойства колониеформирующих эндотелиальных клеток в сравнении с эндотелиальными клетками коронарных артерий. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2022;11(4):90-97. https://doi.org/10.17802/2306-1278-2022-11-4-90-97

26. Jaffe E.A., Nachman R.L., Becker C.G., Minick C.R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J. Clin. Invest. 1973;52(11):2745-2756. https://doi.org/10.1172/JCI107470

27. Ucuzian A.A., Greisler H.P.. In vitro models of angiogenesis. World J Surg. 2007; 31 (4): 654-63. https://doi.org/10.1007/s00268-006-0763-4.

28. Inoue M., Itoh H., Ueda M., Naruko T., Kojima A., Komatsu R., D o i K., Ogawa Y., Tamura N., Takaya K., Igaki T., Yamashita J., Chun T.H., Masatsugu K., Becker A.E., Nakao K. Vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in human coronary atherosclerotic lesions: possible pathophysiological significance of VEGF in progression of atherosclerosis. Circulation. 1998; 98 (20): 2108-16. https://doi.org/10.1161/01.cir.98.20.2108.

29. Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor in the regulation of angiogenesis. Kidney Int. 1999; 56 (3): 794-814. https://doi.org/10.1046/j.1523-1755.1999.00610.x.

30. Fong G.H., Rossant J., Gertsenstein M., Breitman M.L. Role of the Flt-1 receptor tyrosine kinase in regulating the assembly of vascular endothelium. Nature. 1995; 376 (6535): 66-70. https://doi.org/10.1038/376066a0.

31. Nishi J., Minamino T., Miyauchi H., Nojima A., Tateno K., Okada S., Orimo M., Moriya J., Fong G.H., Sunagawa K., Shibuya M., Komuro I. Vascular endothelial growth factor receptor-1 regulates postnatal angiogenesis through inhibition of the excessive activation of Akt. Circ Res. 2008; 103 (3): 261-8. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.108.174128.

32. Veikkola T., Jussila L., Makinen T., Karpanen T., Jeltsch M., Petrova T.V., Kubo H., Thurston G., McDonald D.M., Achen M.G., Stacker S.A., Alitalo K. Signalling via vascular endothelial growth factor receptor-3 is sufficient for lymphangiogenesis in transgenic mice. EMBO J. 2001; 20 (6): 1223-1231. https://doi.org/10.1093/emboj/20.6.1223

33. Dallinga M.G., Habani Y.I., Schimmel A.W.M., Dallinga-Thie G.M., van Noorden C.J.F., Klaassen I., Schlingemann R.O. The Role of Heparan Sulfate and Neuropilin 2 in VEGFA Signaling in Human Endothelial Tip Cells and Non-Tip Cells during Angiogenesis In Vitro. Cells. 2021;10 (4): 926. https://doi.org/10.3390/cells10040926.

34. Evans I.M., Yamaji M., Britton G., Pellet-Many C., Lockie C., Zachary I.C., Frankel P. Neuropilin-1 signaling through p130Cas tyrosine phosphorylation is essential for growth factor-dependent migration of glioma and endothelial cells. Mol Cell Biol. 2011; 31 (6): 1174-85. https://doi.org/10.1128/MCB.00903-10.

35. Brütsch R., Liebler S.S., Wüstehube J., Bartol A., Herberich S.E., Adam M.G., Telzerow A., Augustin H.G., Fischer A. Integ-rin cytoplasmic domain-associated protein-1 attenuates sprouting angiogenesis. Circ Res. 2010; 107 (5): 592-601. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.110.217257.

36. Wang Y., Yang C., Gu Q., Sims M., Gu W., Pfeffer L.M., Yue J. KLF4 Promotes Angiogenesis by Activating VEGF Signaling in Human Retinal Microvascular Endothelial Cells. PLoS One. 2015; 10(6): e0130341. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130341.

37. Rezzola S., Di Somma M., Corsini M., Leali D., Ravelli C., Polli V.A.B., Grillo E., Presta M., Mitola S. VEGFR2 activation mediates the pro-angiogenic activity of BMP4. Angiogenesis. 2019; 22 (4): 521-533. https://doi.org/10.1007/s10456-019-09676-y.

38. Wang H., Su Y.. Collagen IV contributes to nitric oxide-induced angiogenesis of lung endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 2011; 300 (5): C979-88. https://doi.org/10.1152/ajp-cell.00368.2010.

39. Kalucka J., de Rooij L.P.M.H., Goveia J., Rohlenova K, Dumas S.J, Meta E., Conchinha N.V., Taverna F., Teuwen L.A., Veys K., García-Caballero M., Khan S., Geldhof V., Sokol L., Chen R., Treps L., Borri M., de Zeeuw P., Dubois C., Karakach T.K., Falken-berg K.D., Parys M., Yin X., Vinckier S., Du Y., Fenton R.A., Schoonjans L., Dewerchin M., Eelen G., Thienpont B., Lin L., Bo-lund L., Li X., Luo Y., Carmeliet P. Single-Cell Transcriptome Atlas of Murine Endothelial Cells. Cell. 2020;180(4):764-779.e20. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.01.015.

40. Brulois K., Rajaraman A., Szade A., Nordling S., Bogoslows-ki A., Dermadi D., Rahman M., Kiefel H., O'Hara E., Koning J.J., Kawashima H., Zhou B., Vestweber D., Red-Horse K., Mebius R.E., Adams R.H., Kubes P., Pan J., Butcher E.C. A molecular map of murine lymph node blood vascular endothelium at single cell resolution. Nat. Commun. 2020;11(1):3798. https://doi.org/10.1038/s41467-020-17291-5