Анализ внутреннего пути апоптоза в эндотелиальных клетках под воздействием кальций-фосфатных бионов

Цель. Изучить внутренний путь апоптоза в первичных артериальных эндотелиальных клетках в результате их экспозиции кальций-фосфатным бионам (КФБ).
Материалы и методы. Первичные эндотелиальные клетки коронарной артерии человека были экспонированы сферическим и игольчатым КФБ в течение 4 часов с последующим выделением общего белка и фракционированием органелл с разделением митохондриального и цитозольного белка. При помощи иммуноблоттинга определяли уровень митохондриального маркера потенциал-зависимого анионоселективного канала 1, цитозольного маркера глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и белков внутреннего пути апоптоза цитохрома с, HtrA2/Omi в митохондриях и цитозоле, а также уровень общей и активной каспазы-9 и каспазы-3 в общем белке, собранном с вышеуказанных культур эндотелиальных клеток в трех независимых экспериментах.
Результаты. Воздействие КФБ не всегда сопровождалось транслокацией данных белков из митохондрий в цитозоль. В зависимости от формы КФБ образцы выделенного из первичных артериальных эндотелиальных клеток белка различались как по спектру, так и по содержанию специфических белков. Лишь один эксперимент из трех показал стойкое повышение уровня активной каспазы-9 и каспазы-3 в экспонированных КФБ клетках в сравнении с контрольной группой (ФСБ), в то время как в остальных каспазы либо детектировались нестабильно, либо уровень активных каспаз не различался между контрольной и опытными группами. Уровни общей и активной каспазы-9 и каспазы-3 характеризовались конкордантностью, что свидетельствует о прямой корреляции между данными апоптотическими ферментами.
Заключение. Представленные результаты показали неоднозначность механизмов эндотелиотоксического действия КФБ и необходимость дальнейшей расшифровки путей клеточной гибели под воздействием сферических КФБ и игольчатых КФБ, а также необходимость совершенствования методики оценки молекулярных путей клеточной гибели под воздействием КФБ.

1. Kutikhin AG, Velikanova EA, Mukhamadiyarov RA, Glushkova TV, Borisov VV, Matveeva VG, Antonova LV, Filip'ev DE, Golovkin AS, Shishkova DK, Burago AY, Frolov AV, Dolgov VY, Efimova OS, Popova AN, Malysheva VY, Vladimirov AA, Sozinov SA, Ismagilov ZR, Russakov DM, Lomzov AA, Pyshnyi DV, Gutakovsky AK, Zhivodkov YA, Demidov EA, Peltek SE, Dolganyuk VF, Babich OO, Grigoriev EV, Brusina EB, Barbarash OL, Yuzhalin AE. Apoptosis-mediated endothelial toxicity but not direct calcification or functional changes in anti-calcification proteins defines pathogenic effects of calcium phosphate bions. Sci Rep. 2016;6:27255. https://doi.org/10.1038/srep27255

2. Smith ER, Hewitson TD, Jahnen-Dechent W. Calciprotein particles: mineral behaving badly? Curr Opin Nephrol Hypertens. 2020;29(4):378-386. https://doi.org/10.1097/MNH.0000000000000609

3. Herrmann M, Schäfer C, Heiss A, Gräber S, Kinkeldey A, Büscher A, Schmitt MM, Bornemann J, Nimmerjahn F, Herrmann M, Helming L, Gordon S, Jahnen-Dechent W. Clearance of fetuin-A--containing calciprotein particles is mediated by scavenger receptor-A. Circ Res. 2012;111(5):575-584. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.111.261479

4. Köppert S, Büscher A, Babler A, Ghallab A, Buhl EM, Latz E, Hengstler JG, Smith ER, Jahnen-Dechent W. Cellular Clearance and Biological Activity of Calciprotein Particles Depend on Their Maturation State and Crystallinity. Front Immunol. 2018;9:1991. https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.01991

5. Peng HH, Wu CY, Young D, Martel J, Young A, Ojcius DM, Lee YH, Young JD. Physicochemical and biological properties of biomimetic mineralo-protein nanoparticles formed spontaneously in biological fluids. Small. 2013;9(13):2297-2307. https://doi.org/10.1002/smll.201202270

6. Шишкова Д.К., Синицкий М.Ю., Великанова Е.А., Кутихин А.Г. Кальций-фосфатные бионы индуцируют секрецию провоспалительных цитокинов интерлейкина-6 и интерлейкина-8 артериальными эндотелиальными клетками in vitro. Цитокины и воспаление. 2018;17(1-4):80 [Shishkova DK, Sinitsky MYu, Velikanova EA, Kutikhin AG. Calcium phosphate bions induce secretion of pro-inflammatory cytokines interleukin-6 and interleukin-8 by arterial endothelial cells in vitro. Cytokines and Inflammation. 2018;17(1-4):80. (In Russ.).]

7. Cahill PA, Redmond EM. Vascular endothelium- Gatekeeper of vessel health. Atherosclerosis. 2016;248:97-109. https://doi.org/10.1016/j.atherosclerosis.2016.03.007

8. Young JD, Martel J, Young D, Young A, Hung CM, Young L, Chao YJ, Young J, Wu CY. Characterization of granulations of calcium and apatite in serum as pleomorphic mineraloprotein complexes and as precursors of putative nanobacteria. PLoS One. 2009;4(5):e5421. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005421

9. Кутихин А.Г., Великанова Е.А., Шишкова Д.К., Матвеева В.Г., Григорьев Е.В., Барбараш О.Л. Форма кальций-фосфатных бионов определяет их токсичность для культур эндотелиальных клеток человека. Кардиологический вестник. 2019;XIV(4):34-41 [Kutikhin AG, Velikanova EA, Shishkova DK, Matveeva VG, Grigoriev EV, Barbarash OL. Shape of calcium phosphate bions dictates their toxicity for human venous and arterial endothelial cells. Cardiology Bulletin. 2019;XIV(4):34-41. (In Russ.).] https://doi.org/10.36396/MS.2019.15.4.004

10. Lebre F, Sridharan R, Sawkins MJ, Kelly DJ, Obrien F, Lavelle EC. The shape and size of hydroxyapatite particles dictate inflammatory responses following implantation. Sci Rep. 2017;7(1):2922. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03086-0

11. Sukhanova A, Bozrova SV, Sokolov PY, Berestovoy MA, Karaulov A, Nabiev I. Dependence of Nanoparticle Toxicity on Their Physical and Chemical Properties. Nanoscale Res Lett. 2018;13(1):44. https://doi.org/10.1186/s11671-018-2457-x

12. Galluzzi L, Vitale I, Aaronson SA, Abrams JM, Adam D, Agostinis P, Alnemri ES, Altucci L, Amelio I, Andrews DW, Annicchiarico-Petruzzelli M, Antonov AV, Arama E, Baehrecke EH, Barlev NA, Bazan NG, Bernassola F, Bertrand MJM, Bianchi K, Blagosklonny MV, Blomgren K, Borner C, Boya P, Brenner C, Campanella M, Candi E, Carmona-Gutierrez D, Cecconi F, Chan FK, Chandel NS, Cheng EH, Chipuk JE, Cidlowski JA, Ciechanover A, Cohen GM, Conrad M, Cubillos-Ruiz JR, Czabotar PE, D'Angiolella V, Dawson TM, Dawson VL, De Laurenzi V, De Maria R, Debatin KM, DeBerardinis RJ, Deshmukh M, Di Daniele N, Di Virgilio F, Dixit VM, Dixon SJ, Duckett CS, Dynlacht BD, El-Deiry WS, Elrod JW, Fimia GM, Fulda S, García-Sáez AJ, Garg AD, Garrido C, Gavathiotis E, Golstein P, Gottlieb E, Green DR, Greene LA, Gronemeyer H, Gross A, Hajnoczky G, Hardwick JM, Harris IS, Hengartner MO, Hetz C, Ichijo H, Jäättelä M, Joseph B, Jost PJ, Juin PP, Kaiser WJ, Karin M, Kaufmann T, Kepp O, Kimchi A, Kitsis RN, Klionsky DJ, Knight RA, Kumar S, Lee SW, Lemasters JJ, Levine B, Linkermann A, Lipton SA, Lockshin RA, López-Otín C, Lowe SW, Luedde T, Lugli E, MacFarlane M, Madeo F, Malewicz M, Malorni W, Manic G, Marine JC, Martin SJ, Martinou JC, Medema JP, Mehlen P, Meier P, Melino S, Miao EA, Molkentin JD, Moll UM, Muñoz-Pinedo C, Nagata S, Nuñez G, Oberst A, Oren M, Overholtzer M, Pagano M, Panaretakis T, Pasparakis M, Penninger JM, Pereira DM, Pervaiz S, Peter ME, Piacentini M, Pinton P, Prehn JHM, Puthalakath H, Rabinovich GA, Rehm M, Rizzuto R, Rodrigues CMP, Rubinsztein DC, Rudel T, Ryan KM, Sayan E, Scorrano L, Shao F, Shi Y, Silke J, Simon HU, Sistigu A, Stockwell BR, Strasser A, Szabadkai G, Tait SWG, Tang D, Tavernarakis N, Thorburn A, Tsujimoto Y, Turk B, Vanden Berghe T, Vandenabeele P, Vander Heiden MG, Villunger A, Virgin HW, Vousden KH, Vucic D, Wagner EF, Walczak H, Wallach D, Wang Y, Wells JA, Wood W, Yuan J, Zakeri Z, Zhivotovsky B, Zitvogel L, Melino G, Kroemer G. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death Differ. 2018;25:486-541. https://doi.org/10.1038/s41418-017-0012-4

13. Droga-Mazovec G, Bojic L, Petelin A, Ivanova S, Romih R, Repnik U, Salvesen GS, Stoka V, Turk V, Turk B. Cysteine cathepsins trigger caspase-dependent cell death through cleavage of bid and antiapoptotic Bcl-2 homologues. J Biol Chem. 2008;283(27):19140-19150. https://doi.org/10.1074/jbc.M802513200

14. Bidère N, Lorenzo HK, Carmona S, Laforge M, Harper F, Dumont C, Senik A. Cathepsin D triggers Bax activation, resulting in selective apoptosis-inducing factor (AIF) relocation in T lymphocytes entering the early commitment phase to apoptosis. J Biol Chem. 2003;278(33):31401-31411. https://doi.org/10.1074/jbc.M301911200

15. Шишкова Д.К., Великанова Е.А., Мухамадияров Р.А., Южалин А.Е., Кудрявцева Ю.А., Попова А.Н., Руссаков Д.М., Кутихин А.Г. Изучение механизма специфичной эндотелиотоксичности кальций-фосфатных бионов. Сибирский научный медицинский журнал. 2019;39(4):12-21 [Shishkova DK, Velikanova EA, Mukhamadiyarov RA, Yuzhalin AE, Kudryavtseva YuA, Popova AN, Russakov DM, Kutikhin AG. Lysosome-dependent cell death defines specific endothelial toxicity of calcium phosphate bions. Sibirskiy nauchnyy meditsinskiy zhurnal. 2019;39(4):12-21. (In Russ.).] https://doi.org/10.15372/SSMJ20190402

16. Kim HE, Du F, Fang M, Wang X. Formation of apoptosome is initiated by cytochrome c-induced dATP hydrolysis and subsequent nucleotide exchange on Apaf-1. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(49):17545-17550. https://doi.org/10.1073/pnas.0507900102

17. Reubold TF, Eschenburg S. A molecular view on signal transduction by the apoptosome. Cell Signal. 2012;24(7):1420- 1425. https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2012.03.007

18. Yuan S, Akey CW. Apoptosome structure, assembly, and procaspase activation. Structure. 2013;21(4):501-515. https://doi.org/10.1016/j.str.2013.02.024

19. Zou H, Li Y, Liu X, Wang X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 1999;274(17):11549-11556. https://doi.org/10.1074/jbc.274.17.11549

20. Li Y, Zhou M, Hu Q, Bai XC, Huang W, Scheres SH, Shi Y. Mechanistic insights into caspase-9 activation by the structure of the apoptosome holoenzyme. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(7):1542-1547. https://doi.org/10.1073/pnas.1620626114

21. Shi Y. Caspase activation, inhibition, and reactivation: a mechanistic view. Protein Sci. 2004;13(8):1979-1987. https://doi.org/10.1110/ps.04789804

22. Lavrik IN, Golks A, Krammer PH. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J Clin Invest. 2005;115(10):2665- 2672. https://doi.org/10.1172/JCI26252

23. Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, Srinivasula SM, Ahmad M, Alnemri ES, Wang X. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 1997;91(4):479-489. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(00)80434-1

24. Fujita E, Egashira J, Urase K, Kuida K, Momoi T. Caspase-9 processing by caspase-3 via a feedback amplification loop in vivo. Cell Death Differ. 2001;8(4):335-344. https://doi.org/10.1038/sj.cdd.4400824

25. Bratton SB, Walker G, Srinivasula SM, Sun XM, Butterworth M, Alnemri ES, Cohen GM. Recruitment, activation and retention of caspases-9 and -3 by Apaf-1 apoptosome and associated XIAP complexes. EMBO J. 2001;20(5):998-1009. https://doi.org/10.1093/emboj/20.5.998

26. Shiozaki EN, Chai J, Rigotti DJ, Riedl SJ, Li P, Srinivasula SM, Alnemri ES, Fairman R, Shi Y. Mechanism of XIAP-mediated inhibition of caspase-9. Mol Cell. 2003;11(2):519-527. https://doi.org/10.1016/s1097-2765(03)00054-6

27. Wu G, Chai J, Suber TL, Wu JW, Du C, Wang X, Shi Y. Structural basis of IAP recognition by Smac/DIABLO. Nature. 2000;408(6815):1008-1012. https://doi.org/10.1038/35050012

28. Gao Z, Tian Y, Wang J, Yin Q, Wu H, Li YM, Jiang X. A dimeric Smac/diablo peptide directly relieves caspase-3 inhibition by XIAP. Dynamic and cooperative regulation of XIAP by Smac/ Diablo. J Biol Chem. 2007;282(42):30718-30727. https://doi.org/10.1074/jbc.M705258200

29. Martins LM, Iaccarino I, Tenev T, Gschmeissner S, Totty NF, Lemoine NR, Savopoulos J, Gray CW, Creasy CL, Dingwall C, Downward J. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 2002;277(1):439-444. https://doi.org/10.1074/jbc.M109784200

30. Vande Walle L, Lamkanfi M, Vandenabeele P. The mitochondrial serine protease HtrA2/Omi: an overview. Cell Death Differ. 2008;15(3):453-460. https://doi.org/10.1038/sj.cdd.4402291

31. Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, Okawa K, Iwamatsu A, Nagata S. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 1998;391(6662):43- 50. https://doi.org/10.1038/34112

32. Sakahira H, Enari M, Nagata S. Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis. Nature. 1998;391(6662):96-99. https://doi.org/10.1038/34214

33. Larsen BD, Sørensen CS. The caspase-activated DNase: apoptosis and beyond. FEBS J. 2017;284(8):1160-1170. https://doi.org/10.1111/febs.13970

34. Шишкова Д.К., Глушкова Т.В., Ефимова О.С., Попова А.Н., Малышева В.Ю., Колмыков Р.П., Исмагилов З.Р., Гутаковский А.К., Живодков Ю.А., Кожухов А.С., Севостьянов О.Г., Долганюк В.Ф., Кудрявцева Ю.А., Кутихин А.Г. Морфологическая и химическая характеризация магний-фосфатных и кальций-фосфатных бионов. Фундаментальная и клиническая медицина. 2019;4(2):6- 16 [Shishkova DK, Glushkova TV, Efimova OS, Popova AN, Malysheva VYu, Kolmykov RP, Ismagilov ZR, Gutakovsky AK, Zhivodkov YuA, Kozhukhov AS, Sevostyanov OG, Dolganyuk VF, Kudryavtseva YuA, Kutikhin AG. Morphological and chemical characterization of magnesium phosphate and calcium phosphate bions. Fundamental and Clinical Medicine. 2019;4(2):6-16. (In Russ.).] https://doi.org/10.23946/2500-0764-2019-4-2-6-16

35. Шишкова Д.К., Глушкова Т.В., Ефимова О.С., Попова А.Н., Малышева В.Ю., Колмыков Р.П., Исмагилов З.Р., Гутаковский А.К., Живодков Ю.А., Кожухов А.С., Долганюк В.Ф., Барбараш О.Л., Кутихин А.Г. Сравнение морфологических и химических свойств сферических и игольчатых кальций-фосфатных бионов. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2019;8(1):59-69 [Shishkova DK, Glushkova TV, Efimova OS, Popova AN, Malysheva VYu, Kolmykov RP, Ismagilov ZR, Gutakovsky AK, Zhivodkov YuA, Kozhukhov AS, Dolganyuk VF, Barbarash OL, Kutikhin AG. Morphological and chemical properties of spherical and needle calcium phosphate bions. Kompleksnye problemy serdechno-sosudistykh zabolevaniy. 2019;8(1):59-69 2019.(In Russ.).] https://doi.org/10.17802/2306-1278-2019-8-1-59-69